細(xì)胞株購買就選科佰！外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)表達(dá)，一類是穩(wěn)定表達(dá)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天。后者外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長(zhǎng)期表達(dá)目的基因。建立穩(wěn)定細(xì)胞株，一般是根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選。常用的抗性標(biāo)記基因有潮霉素（hygromycin）、新霉素（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin進(jìn)行選擇性篩選。傳統(tǒng)的穩(wěn)定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，終獲得從單一細(xì)胞擴(kuò)增起來的穩(wěn)定細(xì)胞株，該方法陽性率低，周期長(zhǎng)，工作量大。慢病毒是一種RNA病毒，攜帶的外源基因在病毒感染細(xì)胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組以后才能表達(dá)。利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩(wěn)定株的方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得率的穩(wěn)定細(xì)胞株。篩選得到的細(xì)胞或者可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，用于蛋白的擴(kuò)增和富集；或者得到穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞株。

　　篩選穩(wěn)定細(xì)胞株時(shí)出現(xiàn)的問題及其解決辦法：

　　做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選穩(wěn)定細(xì)胞株3周，在6孔板中已經(jīng)長(zhǎng)出一些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴(kuò)散，細(xì)胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起(我的細(xì)胞簇離的很近)，就是說幾個(gè)細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去了，該怎么辦？

　　1.可以減少胰酶量;胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤(rùn)洗細(xì)胞層，以減少可能殘存的血清的影響；

　　2.加入胰酶后，稍過幾秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37度溫箱中繼續(xù)作用1MIN，這時(shí)，消化酶可以繼續(xù)作用的，又可避免胰酶擴(kuò)散；

　　3.顯微鏡下觀察細(xì)胞*松散開，就可以在局部加培養(yǎng)基，并被吸走了；

　　4.具體消化的時(shí)間，注意摸索，如果在步驟b中顯微鏡下見細(xì)胞尚未*松散開，可以再重復(fù)的，直到松散開，能夠被吸走為止。

　　建議：

　　1.在100mm dish中挑克隆，細(xì)胞分的稀一點(diǎn)。

　　2.把細(xì)胞全部消化下來，在96孔板中逐步稀釋篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。

上一篇 : 北京細(xì)胞庫的凍存數(shù)量及管理規(guī)范    下一篇 :  我們來了解下ATCC細(xì)胞的活化方式吧

>> 返回首頁